结肠上皮细胞中胱硫醚合酶的上调促进

编译：周文昌；审校：缪长虹转硫酶胱硫醚-β-合成酶（CBS）及其催化产物硫化氢（H2S）在结直肠肿瘤中表达异常增高，并通过自分泌和旁分泌机制促进肿瘤的增殖和发展，但CBS/H2S轴是否参与结直肠肿瘤的发生依然未知。年Phillips,C.M.等人在《Cancerresearch》上发表了一篇题为《UpregulationofCystathionine-β-synthaseinColonicEpitheliaReprogramsMetabolismandPromotesCarcinogenesis》的文章，分析探讨了胱硫醚-β-合成酶在促进肿瘤发生中的作用机制。现介绍如下：背景：有多项研究证实，CBS在结直肠肿瘤细胞及其衍生细胞系中过表达。反转硫途径是合成半胱氨酸的主要代谢途径，而CBS则是反转硫途径的第一个也是主要的限速酶，同时也是甲硫氨酸代谢的关键酶。CBS催化同型半胱氨酸和丝氨酸缩合合成胱硫醚，然后胱硫醚被胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）水解为半胱氨酸，半胱氨酸可以合成蛋白质、谷胱甘肽及气体神经递质H2S。因此CBS和CSE是H2S合成代谢的两个关键酶。在结直肠肿瘤细胞及其衍生细胞系中，H2S合成代谢依赖CBS而非CSE，且以浓度依赖的方式调节相关细胞的生物能代谢。CBS/H2S信号轴通过调控肿瘤细胞自分泌促进增殖、转移和生物能代谢，也可通过旁分泌调节肿瘤血管生成，进而促进结直肠肿瘤的生长和转移。CBS在其他多种类型的肿瘤中也能促进肿瘤的增长、转移，增强其对化疗的抗性，说明CBS在促进已患肿瘤发展中发挥重要作用，但其是否参与并促进肿瘤发生依然有待研究。该研究首先在临床活检组织中发现人癌前病变（腺瘤性息肉）中CBS的表达增加。实验室研究中发现在癌前结肠上皮细胞系(NCM细胞)中人为的上调CBS表达可引起代谢重新编码及诱导侵袭性癌型基因表型表达。同时研究结果明确了CBS基因与肿瘤诱导剂诱导的异常结肠隐窝形成有直接相关性，从而证实CBS的促肿瘤作用。结果：1.结肠息肉中CBS表达增加人体活检标本发现：相比于正常上皮，腺瘤、腺癌标本的CBS表达水平明显增高（图1A，B），而CSE则未见明显差异；结肠隐窝侧基底层有少量细胞存在CBS免疫反应，且与正常粘膜相比，增生性息肉组织CBS表达有所增加（图1C，D）；管状腺瘤标本的上皮细胞弥漫性胞质CBS染色水平更高，且与含黏液囊泡相邻的病灶区有极强的免疫染色；腺癌切片则显示癌细胞胞浆弥漫的CBS染色(图1F)。此外，在紧邻腺癌细胞的粘膜隐窝中，上皮细胞的细胞质中CBS染色增加，在分泌粘液的杯状细胞的基底层也有高水平CBS表达(图1G)。以上结果显示：CBS可能在肿瘤的发生、发展中有着重要作用。2.NCM细胞中过表达CBS为研究CBS在结直肠癌发生中可能的作用，研究者选用了NCM细胞进行离体研究。使用了慢病毒过表达CBS，两个对照组中均未见CBS表达(图2A)；表达重组酶的细胞中内源性CBS的表达增加(图2A)；分别以5和15感染复数(multiplicityofinfection,MOI)(即病毒颗粒数量：细胞数量)转导的CBS1和CBS2细胞之间的CBS总表达量大约有3倍的差异(图2A,B)；而NCM细胞中CSE的水平未受到CBS过表达的影响（图2C，D）。3.CBS过表达改变NCM细胞的代谢对NCM过表达细胞(CBS2)和空载体转导的对照组的细胞提取物进行了全局代谢谱(Metabolon,Durham,NC)分析发现：有差异的代谢产物主要集中于糖代谢，包括糖酵解、丙酮酸代谢、核苷酸糖和戊糖磷酸途径；脂质生物合成，包括磷脂、鞘脂和胆汁酸；辅因子和维生素，包括烟酸和烟酰胺代谢、核黄素和维生素B6代谢；以及二肽的合成，提示CBS过表达引起细胞能量代谢的异常重新编码。CBS过表达也增加了反转硫酸途径通量，与对照的空病毒转导细胞相比，CBS2细胞中s-腺苷基同型半胱氨酸和同型半胱氨酸水平显著降低，而胱硫醚的水平升高(图2E)。与空病毒转导对照组相比，CBS2细胞中基础H2S的产生大约增加了4倍(图2F,G)。CBS拮抗剂处理可使CBS2细胞中H2S水平降低约10倍，使空病毒对照组中H2S水平降低4倍(图2G)。4.过表达CBS的NCM细胞增殖速度加快CBS2增殖对数期的加倍速度约是对照组的1.3倍，导致细胞数量在第2，3，4天显著增加(图3A,B)。结肠癌细胞系HCT的加倍速度比过表达CBS细胞的快1.4倍，比母系NCM细胞快1.9倍(图3B)。此外，研究者还测试了NCM细胞增殖对转酮酶抑制剂-羟基硫胺和乳酸脱氢酶抑制剂-FX-11的敏感性。羟基硫胺(10μM)显著地抑制CBS2细胞的生长，使其在第五天增长(减少了90%)，但对空病毒载体细胞的增长率无影响(图3C)，乳酸脱氢酶的抑制剂-FX-11(10μM)显著降低了CBS2细胞增殖率，但对照组细胞没有显著影响(图3D)。5.CBS过表达促进NCM细胞的增殖、迁移和侵袭利用transwell评估CBS过表达对细胞迁移和侵袭的影响发现：6小时向成纤维细胞迁移的CBS2细胞约为空病毒转载细胞的3倍(图4A)，24小时后通过基质凝胶的CBS2细胞也约为3倍(图4B)。CBS2迁移量与HCT结肠癌细胞（内源性CBS升高）相当(图4A、B)。使用CBS抑制剂AOAA完全封锁了过表达引起的NCM细胞迁移和侵袭性，但对对照组无明显影响(图4A,B)。利用软琼脂集落形成试验评估细胞不依赖于锚定方式增殖的能力，是检测细胞抗脱落凋亡能力的替代实验。结果发现：只有过表达CBS的细胞在软琼脂中形成菌落(图4C)。培养3周后，CBS2细胞培养每个HPF观察到平均6个菌落(图4C)。相比之下，在空病毒转载的NCM和AOAA处理的细胞培养中只观察到偶见的小细胞簇(1perHPF)(图4C)。为了确定H2S是否可以替代CBS，实验使用缓释H2S供体GYY处理原代和空病毒载体对照细胞。3周后，在使用GYY处理的2个对照组中均观察到直径为20-25μm的细胞集落(图4D)。6.CBS的过表达增强了NCM细胞的致瘤性为评价CBS上调对NCM细胞致瘤性的影响，将个CBS2或空病毒载体细胞皮下注射到无胸腺裸鼠。第35天所有小鼠的注射部位均有可触及的结节(图5A)；第48天均检测到小鼠的肿瘤生长(图5A)；第60天CBS2组肿瘤体积增大，平均体积约为mm3，而对照组小鼠可触及结节的大小约为50mm3(图5A)。为评估不同水平的CBS表达对体内致瘤性的影响，分别给两组裸鼠注射CBS1和CBS2细胞。第25天两个CBS过表达组均检测到肿瘤生长(图5B)。第35天注射CBS1或CBS2细胞的小鼠的肿瘤明显大于NCM母系细胞组注射部位的小结节(图5B)。第37天和第40天CBS2组的肿瘤明显大于CBS1组(图5B)，说明在体内NCM的致瘤性和生长速度与CBS的表达水平成正相关。为了进一步验证，将2×CBS2细胞注射入10只小鼠并允许肿瘤生长至体积接近mm3(图5C，第29天)。然后每天用AOAA处理小鼠，共10天，CBS抑制剂可使肿瘤体积显著减少，证实CBS活性对NCM细胞致瘤性至关重要。当AOAA治疗停止后，肿瘤生长恢复，但生长速度减慢(图5C)。7.CBS等位基因的缺失可减少由突变引起的结肠异常隐窝病灶(ACF)的数量为了进一步验证CBS在促进结肠癌形成中的作用，该文章评估了CBS对azoxymethane(AOM)诱导小鼠结肠异常隐窝病灶(ACF)形成的影响。用AOM处理CBS杂合子小鼠(CBS+/-)和野生型小鼠(CBS+/+)，每周腹腔注射一次，共5周。在第18周结束后，用亚甲蓝对结肠ACF进行染色(图5D)。结果显示：CBS+/+和CBS+/-的ACFSD均值分别为10.85±5.2和5.57±2.5，CBS+/-小鼠结肠中的ACF约减少一半(图5E)。结论：CBS的异常表达通过促进肿瘤细胞增殖、转移、化疗抵抗等，促进结肠、乳腺、卵巢、前列腺和肺脏等器官已有肿瘤的进一步发展，但其在新生肿瘤发生中的作用尚未阐明。该研究首先发现了人体癌前病变-腺瘤性息肉中CBS的上调。为证实CBS的促肿瘤作用，离体实验采用NCM细胞中过表达CBS基因进一步观察，并研究了CBS基因量与用癌诱导剂诱导小鼠模型中形成AFC的关系。在有APC，KRAS，TP53基因突变的背景下，NCM母系细胞和其空病毒载体转导的对照细胞系不能通过基底凝胶迁移或入侵，在裸鼠中也没有表现出促肿瘤作用，也不能在软琼脂实验中生长。但上调CBS则可使得NCM细胞表现出具有侵入性的腺癌的基因表型，并足以诱导细胞增殖、侵袭、细胞生物能代谢增强，并且在软琼脂中表现为不依赖于锚定生长（即抗脱落凋亡），也能增强免疫缺陷裸鼠的肿瘤形成。此外，一个CBS等位基因的消融（CBS+/-）减少了诱变剂诱导的ACF形成的数量，以上结果足以表明CBS/H2S轴在结肠直肠癌发生的多阶段发展中的关键作用。

“论肿道麻”点评

该研究从多方面证实了CBS/H2S轴在结肠肿瘤发生发展中的作用。NCM细胞模型的研究表明，CBS的上调足以诱导肿瘤细胞的代谢重编程和恶性细胞表型特征。转基因小鼠的基因剂量研究证实了CBS在结肠隐窝转化中的作用。但要阐明CBS/H2S轴致肿瘤作用的分子机制仍需要进行更深入的研究。H2S作为气体递质，已得到医学界的广泛